研究背景：
全身照射(TBI)可引起多种组织器官的损伤。直接作用破坏细胞分子结构，导致功能异常和代谢紊乱。间接作用是通过水辐射产生自由基，引起DNA损伤，进一步增加细胞内自由基水平。大剂量电离辐射对生物大分子的损伤是致命的，可在短时间内导致个体死亡，而低、中剂量辐射下，自由基对DNA的攻击是导致死亡的主要原因。大剂量电离辐射(IR)对生物大分子的损伤是致命性的，可在短时间内导致个体死亡。因此，清除自由基通常被认为是减轻颅脑损伤的主要方法。据报道，许多抗氧化化合物具有辐射防护作用，但很少有化合物具有明显的效果和优异的性能。氨磷汀是氨硫醇的一种，是FDA批准的唯一一种用于头颈部肿瘤放疗后口干的药物。几十年来，氨磷汀中的硫醇和其他氨基硫醇类辐射防护剂被认为是能有效清除自由基和保护辐射损伤的功能性化学基团。然而，化合物中硫醇的数量似乎并不是评估辐射防护效果的唯一因素。Smoluk和他的同事报道，药物与DNA的结合能力可能是辐射防护效果的因素之一。氨磷汀作为前药输送，并通过碱性磷酸酶9脱磷为活性代谢物(WR)；WR-集中在DNA附近，提供足够高的局部浓度，可以有效地清除活性氧(ROS)。据报道，硫醇上的净电荷是化合物辐射防护效果的一个重要因素。Fahl和他的同事报道，带正电荷的烷基胺骨架与带负电荷的DNA骨架结合，提供了最有效的辐射防护氨硫醇化合物。为了增加药物与DNA的亲和力和离子相互作用，从而改善辐射防护。然而，最有效的分子是含有两个氨基的PRC-，而不是其他更多的多胺硫醇化合物。因此，药物与DNA的结合能力与随后的辐射防护效果之间的关系尚未建立起直接的证据。本研究中作者设计了一系列多半胱氨酸肽，包括化合物1、2、3、4、5、6、7、8和9，目的是在保持与氨磷汀相同的辐射防护效果的同时，更好地改善药物的安全性，并得出药物与DNA的结合能力与后续辐射防护效果之间的相关性。
研究思路：
作者首先合成一系列化合物然后探讨其对小鼠的辐射防护作用。如图1A所示，在作者的实验中，总共使用了11个化合物来探索它们对辐射诱导的损伤的保护作用。其中，L型化合物5有三个硫醇基和三个酰胺基，化合物3有两个硫醇基和两个酰胺基，化合物7有四个硫醇基和四个酰胺基，化合物1有一个硫醇基和一个酰胺基；R构型化合物4，化合物6和化合物2分别有两个，三个，一个硫醇基和两个，三个，一个酰胺基。化合物8是L-半胱氨酸的二聚体，化合物9是L-半胱氨酸的三聚体。然后进行30天的存活实验，如图1B，c所示，7.2Gy照射组小鼠存活率为0%，化合物5和氨磷汀治疗组小鼠存活率为80%，其次是化合物3组、化合物6组、化合物4组、化合物4组、化合物9组、化合物1组，小鼠存活率分别为80%、70%、40%、30%、20%和10%，化合物8、化合物2和L-半胱氨酸组小鼠的存活率分别为80%、40%、30%、20%和10%。化合物7和D-半胱氨酸组小鼠无一存活。结果表明，一系列化合物和不同构型的半胱氨酸具有不同的辐射防护效果。
然后用紫外光谱法测定化合物与DNA的结合能力。紫外光谱是研究药物-DNA原始相互作用和复合物形成的最有效技术之一。图2显示了CTDNA在没有和存在不同浓度(0mm-30mm)化合物的情况下的吸收光谱。1/(A?A0)与1/(化合物浓度)的双倒数曲线是线性的，结合常数(K)可以从截距与斜率的比值来估算，其中A0是在没有化合物的情况下游离DNA的初始吸光度，A是在不同化合物浓度下记录的吸光度。计算的结合常数分别为KL-半胱氨酸-CTDNA=2.76×M?1，Kd-半胱氨酸-CTDNA=2.86×M?1，K化合物1-CTDNA=7.76×M?1，K化合物2-CTDNA=4.04×M?1，K化合物3-CTDNA=4.75×M?1，K化合物4-CTDNA=2.24×M?1，K化合物5-CTDNA=9.24×M。K化合物9-CTDNA=5.93×M?1。结果表明，化合物5的结合能力最强。
接着，作者用化合物5进行了实验。结果表明，化合物5提高致死性照射小鼠的存活率。C57BL/6小鼠分别接受7.5、10、12.5和15GyTBI照射。根据已发表的研究，化合物5的最大耐受量(MTD)为1/2，MTD大致相当于LD10剂量，因此在作者的实验中，化合物5的1/2MTD剂量为mg/kg。根据临床经验，氨磷汀对小鼠的最佳剂量为mg/kg。小鼠腹腔注射化合物5和氨磷汀。于伤前20min注射，计算伤后30d内小鼠的存活率。如图3所示，7.5Gy、10Gy、12.5Gy、15Gy四个剂量的赋形剂处理组小鼠30d存活率均为0%，复方5号组7.5Gy、10Gy、12.5Gy、15Gy组小鼠存活率分别为95%、75%、30%、0%，氨磷汀治疗组小鼠存活率分别为%、75%、50%、0%。这些数据表明，化合物5即使在剂量高达12.5Gy的情况下，也能显著降低受照小鼠的死亡率。
同时，化合物5也减轻颅脑损伤所致小鼠造血系统损伤。C57BL/6小鼠接受4Gy全脑照射，复方5号和mg/kg氨磷汀分别腹腔注射mg/kg和mg/kg。伤前20min注射，伤后第15天处死小鼠。作者用血细胞分析仪检测外周血细胞计数，以评估造血干细胞的分化能力。如图4a-f，与对照组比较，化合物5能显著提高4Gy脑损伤小鼠的WBC、RBC、HGB、PLT和LY%，降低NE%，提高WBC、RBC、HGB、PLT和LY%的百分率，降低NE%的百分率，增加WBC、RBC、HGB、PLT和LY%的百分率，与对照组相比，化合物5能显著提高4GyTBI小鼠的WBC、RBC、HGB、PLT和LY%，降低NE%。如图4g-k所示，与对照组相比，骨髓单个核细胞数量、造血祖细胞(HPC)频率、祖细胞Sca1+c-Kit+(LSKs)频率、?+LSKs频率、CD34CD34LSKs频率均降低，CD34CD34LSKs频率增加，化合物5对损伤的BMCs、hPSCs频率有一定的修复作用。脾脏指数和胸腺指数下降，小鼠脾脏和胸腺指数增加多染红细胞中的微核。化合物5能有效改善上述造血系统损伤。化合物5对颅脑损伤所致的造血系统损伤有较强的保护作用。
化合物5也能减轻放射性肺损伤。C57BL/6小鼠接受17Gy右肺照射，腹腔注射化合物5或氨磷汀。照射前20分钟。计算照射后天内的存活率，并在照射后8、16、24周处死小鼠，评估肝纤维化程度。如图5A所示，放疗组、化合物5组和氨磷汀治疗组小鼠的存活率分别为18.57%、28.75%和38.46%，说明化合物5降低了肺照射小鼠的死亡率。根据Masson染色，照射后的肺显示持续的肺泡间隔宽度、纤维性渗出、炎细胞浸润和间质胶原纤维沉积的显著增加。在所有试验时间点，用化合物5或氨磷汀治疗受照小鼠可显著降低肺纤维化程度(图5B)。作者记录了照射后24周的整个新鲜肺的照片，对照处理组的异常肺占66.7%，化合物5组和氨磷汀处理组的肺异常分别占40%和37.5%。提示化合物5具有减轻放射性肺损伤的作用。
化合物5可以减轻颅脑损伤所致胃肠(GI)综合征。由于SI损伤被称为GI综合征的并发症，小鼠将在暴露于超过14Gy的辐射后的7到12天内死亡。为了评价化合物5对胃肠道综合征的辐射防护作用，作者首先进行了存活实验，小鼠接受18GyABI照射前20分钟将化合物5和氨磷汀注射到小鼠腹腔内。如图6a，18Gy对照组小鼠存活率为20%，化合物5和氨磷汀处理组小鼠存活率分别为60%和70%，化合物5和氨磷汀处理组小鼠存活率无显著差异。然后用15GyABI照射小鼠，观察SI的形态学、增殖和凋亡情况。如图6B所示，照射后第5天，化合物5显著改善SI绒毛相对高度的降低。Brdu用于评估SI中的增殖细胞；化合物5处理的小鼠显著保留了增殖细胞(图6C)。在15GyABI前用化合物5处理小鼠，可降低照射后4小时隐窝和绒毛中凋亡细胞(TUNEL阳性细胞)的比率(图6D)。上述结果表明，化合物5对急性颅脑损伤所致胃肠(GI)综合征有一定的缓解作用。
接着，作者探讨了化合物5减轻ABI胃肠道综合征的作用机制。为了进一步探讨化合物5的作用机理，作者进行了RNA序列实验。如图7a，b所示，化合物5处理可诱导个基因发生变化，其中82个基因上调，个基因下调。在这些基因中，Cth调节胱硫酮向半胱氨酸的转化，这是GSH合成所必需的23；Nox1和rac2是RhoGTP酶激活NADPH氧化酶，专用于产生ROS，如超氧化物24，25。反应组数据库富集分析表明，化合物5上调了辐射后肠隐窝细胞的生物氧化、氨基酸合成和代谢过程；下调了辐射后红细胞的吸氧和释放二氧化碳、清除血浆中的血红素以及RhoGTPase活性的NADPH氧化酶过程(图7C-I)。这些数据表明，化合物5主要调节氧化还原平衡和氨基酸的合成代谢，以保护机体免受辐射损伤。
为了评价化合物5对细胞内活性氧(ROS)的清除作用，作者检测了不同种类的活性氧(ROS)。作者首先检测了照射后IEC6细胞的总ROS水平，如图8A所示，10Gy照射后4h，IEC6细胞的总ROS水平没有明显升高；然后我们进一步检测了脂质ROS、线粒体ROS和超氧阴离子自由基水平。结果表明，辐射诱导脂质ROS升高。众所周知，脂质ROS的积聚会导致铁死亡，因此作者提出了化合物5可能抑制IR诱导的铁死亡的假设。作者在实验中使用铁死亡抑制剂Liproxstatin-1作为阳性对照，如图8A所示，类似于Liproxstatin-1，化合物5降低了总ROS和脂质ROS水平。以GSH耗竭、谷胱甘肽过氧化物酶4(Gpx4)活性丧失以及随后脂质ROS积聚为特征的铁死亡，接下来作者检测GSH水平和Gpx4蛋白的表达。如图8B所示，IR可引起GSH水平下降，化合物5或Liproxstatin-1可显著提高GSH含量，甚至超过对照组的GSH水平。化合物5上调Gpx4蛋白在IEC6细胞和辐照SI组织中的表达(图8C)。接下来，作者对脂质ROS的来源进行了检测，根据RNA测序的结果，NOX1在辐射小鼠的SI隐窝中显著上调，而化合物5与氨磷汀不同，它显著下调了NOX1蛋白的水平，因此作者在实验中使用了NOX1抑制剂ML。ML可以特异性地清除脂质ROS，并提高IEC6细胞的GSH水平，提示NOX1可能与脂质ROS的产生有关。鉴于目前尚无研究提及铁死亡在IR诱导的SI损伤中的作用，本研究旨在探讨抑制铁死亡是否能减轻IR诱导的SI损伤。如图8d-f所示，Liproxstatin-1可提高照射后IEC6细胞的存活率和集落数，且10mg/kgLiproxstatin-1能有效提高致死性ABI小鼠的存活率(图8g)。上述结果提示IR可激活SI的铁死亡，化合物5可抑制铁死亡，减轻IR所致的GI综合征。为了进一步证实化合物5对铁死亡的治疗作用，作者用CIL56、erastin和IKE与IEC6细胞共培养来触发铁死亡；化合物5可以有效地抑制铁死亡，提高细胞存活率(图8H)。然后，作者给小鼠灌胃20mg/kgIKE，连续5天，如图8I所示。与对照组相比，IKE治疗组大鼠肾小管内隐窝和绒毛结构遭到破坏，肾脏炎性细胞浸润明显增多。化合物5能明显改善腺泡和绒毛结构破坏及炎性细胞浸润；IKE还能下调Gpx4蛋白的表达，而化合物5能上调Gpx4蛋白水平(图8j)。以上数据表明化合物5是一种有效的铁死亡抑制剂。
结论：
聚半胱氨酸是一种新型的辐射防护剂。其中化合物5的药效最高，与氨磷汀相当，安全性更好。为了用直接证据证明化合物DNA结合能力与辐射防护效果的相关性，人们制备了一系列L构型和相应的D-构型多半胱氨酸肽，并呈现出结合力越高，辐射防护效果越好的趋势。为了探讨聚半胱氨酸作为辐射防护剂的作用机理，作者进行了一系列的体内和体外实验，结果表明铁死亡途径参与了化合物5的辐射防护作用(图9)。因此，本文设计了一种新型的放射性防护器，并对其具体的发病机制进行了研究。
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