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接《新冠肺炎的诊与疗｜诊断篇上》
3：实时荧光定量PCR方法学
关键词：技术普及化、成本较低、检测时长较短、供应链成熟、初筛
年2月，强生公司以28亿美元出售其高级消*产品ASP业务给Fortive公司。Fortive公司将支付包括27亿美元现金和1亿美元的保留应收款。该交易PS3.5x、EBITDA13.9x。
作为分子诊断传统方法学，实时荧光PCR是一种快速简便、成本较低，且已在临床广泛使用的感染性病原体核酸检测技术。在本次新冠肺炎疫情中的表现也相当亮眼，首批获证的试剂盒都是实时荧光PCR，第一时间辅助临床进行确诊判断。
实时荧光定量PCR仪是指在PCR反应体系中加入能够指示DNA片段扩增过程的荧光染料（SYBRGreen等）或荧光标记的特异性的探针（TaqManProbe等），在普通PCR仪设计基础上增加荧光信号激发和采集系统和计算机分析处理系统，形成了具有荧光定量PCR功能的仪器，通过对PCR过程中生的荧光信号积累实时监测整个PCR过程，再结合相应的计算机软件对所获得的荧光信号数据进行分析，计算待测样品特定DNA片段的初始浓度。
由于本次新冠肺炎疫情发生突然，且传播能力较强，短时间内需要对大量的疑似人群进行检测，优选的检测方法除了保证针对新冠病*的特异性，还要兼顾方法学的普及性、成本、操作人员等多方面因素，保障该方法能短时间快速开展。实时荧光PCR通过引入新冠病*特异性引物对待测样本中新冠病*中的一段RNA片断进行扩增并检测，具备灵敏度、特异度较高的特点。若核酸检测阳性，便能确认新冠病*的感染，这也是核酸检测成为新冠肺炎“金标准”的原因。
此外，由于qPCR技术引入国内已久，技术普及程度较高，医院已建立负责资质要求的PCR实验室，并搭建成熟的PCR技术人员，在应对新冠肺炎突发疫情时，有足够的场地、设备和人员进行检测。实操层面上，qPCR的操作较简单、耗时较短，检测时间一般2小时以内可以完成，有利于实现本次疫情中尽早诊断、尽早隔离、尽早诊疗的防疫方案。另一角度，从试剂的供给端看，国内在分子诊断领域已有诸多发展较成熟的试剂厂家，主要针对qPCR技术有成熟的研发、生产经验，才能在这么短的时间内完成研发并且保证大量试剂的供应。
1）国际代表企业介绍
赛默飞
赛默飞作为领先的分子生物学检测方案供应商，拥有完整的病*检测解决方案，包括核酸提取、荧光定量PCR、一代测序、高通量测序等。此次新冠肺炎疫情爆发，快速获批的多款新型冠状病*核酸检测试剂盒全部适配赛默飞AppliedBiosystems荧光定量PCR仪，也有部分试剂在此基础上适配了新一代的AppliedBiosystemsQuantStudio5荧光定量PCR仪。
根据近日一份报告的统计，自《新型冠状病*肺炎防控方案》发布以来，至2月29医院、疾控中心、卫健委的部分采购情况统计中，赛默飞qPCR的采购量占比第一，达到59.34%，赛默飞和QuantStudioDX2款设备的采购量最大。
2）国内相关企业介绍
国内目前研发出新冠肺炎检测试剂盒的qPCR公司不下家，但目前获得NMPA注册证的共有8家。
圣湘生物
圣湘生物是一家以自主创新基因技术为核心，集诊断试剂、仪器、第三方医学检验服务为一体的体外诊断整体解决方案提供商，搭建了荧光定量PCR、基因芯片、基因测序、移动分子诊断、生物信息等一系列分子诊断技术平台。其业务当中分子诊断业务占到70%以上，重点方向为传染病，如乙肝、艾滋等。圣湘在此前也开发了冠状病*（SARS、中东呼吸综合征等）、非洲猪瘟病*、埃博拉病*、寨卡病*、禽流感病*、登革热病*等重大疫情相关的核酸检测产品，有比较丰富的感染类疾病核酸试剂的开发经验。
在本次新冠肺炎疫情中，圣湘生物可谓收获满满，不仅1月28日获得了新型冠状病*-nCoV核酸检测试剂盒（荧光PCR法）的NMPA应急审批，3月3日该试剂盒也接连获得欧盟CE认证。此外，圣湘生物也快速递交了登陆科创板的申请，上交所对疫情防控相关企业采取了即报即受理措施，并在第一时间组织专家进行评审。
（表）国内研发新冠肺炎检测试剂盒qPCR公司
来源：浩悦资本
4：数字PCR方法学
关键词：高灵敏度、绝对定量、动态监测、弱阳性确认、无症状携带者筛查
数字PCR是一种单分子高灵敏的补充检测方法。数字PCR(digitalPCR,dPCR)的核心原理是是一种对含有核酸分子的标准反应体系进行有限稀释，使稀释后的每个反应含或不含一个或者多个拷贝的待检靶分子（DNA模板），实现每个反应为一个独立的PCR反应器，经PCR扩增后对每个独立反应进行检测，并以终点信号的有或无作为判断标准（有荧光信号的微滴判读为“1”，无荧光信号的微滴判读为“0”）。最后，根据泊松分布原理及阳性反应器的比例，利用分析软件计算待检靶分子的浓度或拷贝数，从而获得最终结果。所以，数字PCR无需对照标准样品和标准曲线，不依赖于Ct值来实现绝对定量。通过终点检测法，可以直接数出目标DNA分子的个数，实现“单分子模板扩增”的绝对定量，极大提高了检测灵敏度和准确性。国际上荧光定量PCR的龙头厂家如Bio-Rad和ThermoFisher也看到了数字PCR平台的价值，自年开始相继布局。
（图）数字PCR检验流程
来源：Bio-rad.